New Phytologist（IF=8.1）|DAP-seq助力解析擬南芥雄性育性調控網(wǎng)絡

2025年7月6日，浙江大學徐娟教授團隊在New Phytologist期刊發(fā)表了一篇題為“A DELLA-ANAC106 reciprocal negative feedback circuit modulates gibberellin homeostasis to regulate male fertility in Arabidopsis"研究論文。該研究借助DAP-seq技術揭示了擬南芥中DELLA-ANAC106雙向負反饋回路調控赤霉素（GA）穩(wěn)態(tài)以維持雄性育性的分子機制，為植物生殖過程中植物激素調控提供新范式，也為作物遺傳改良提供了重要的理論基礎和潛在靶點。

文章主要內容

研究背景

花粉形成是開花植物繁殖的關鍵，其發(fā)育與花藥絨氈層（最內層細胞）的精準調控緊密相關。絨氈層需通過程序性細胞死亡（PCD）為花粉提供營養(yǎng)，提前或延遲降解均會致花粉敗育。赤霉素（GA）的劑量與合成位置對花粉發(fā)育至關重要：GA缺陷突變體（如ga1-3）花粉發(fā)育停滯，過量GA也會引發(fā)雄性不育，足見GA穩(wěn)態(tài)是育性核心調控因素。

GA通過結合受體GID1降解DELLA抑制蛋白激活信號，擬南芥中DELLA蛋白（如RGA、GAI）是花藥發(fā)育關鍵抑制因子，其突變會致不育。雖GA代謝通路已明晰，但花粉發(fā)育中GA水平調控的分子機制仍不明，且NAC轉錄因子家族在該過程中的作用未知。

研究結果

研究發(fā)現(xiàn)AT3G12910受MPK3/MPK6激活上調，經(jīng)鑒定為新NAC轉錄因子ANAC106。為研究其功能，作者構建了ANAC106過表達株系（OE），發(fā)現(xiàn)高表達株系嚴重矮化無花序，中等表達株系表現(xiàn)為雄性不育，無法形成可育角果。亞歷山大染色顯示，OE株系花藥無可育花粉；野生型花粉授粉可使OE株系結籽，表明其雌性器官功能正常。GUS染色顯示，ANAC106在幼嫩花藥中高表達，表明其在雄性生殖過程中的特異性作用。作者進一步構建了ANAC106-EAR顯性負性株系，發(fā)現(xiàn)EAR株系與OE株系表型相似，均表現(xiàn)為雄性不育，花藥成熟花粉極少；且自身啟動子驅動的該株系也不育。綜上表明，ANAC106過表達與抑制的正常功能與均會導致擬南芥雄性不育。

圖1. 過量表達ANAC106導致擬南芥雄性嚴重不育

圖2. 顯性負調控ANAC106同樣會導致擬南芥雄性不育

為探究OE和EAR株系雄性不育機制，作者觀察不同發(fā)育階段花藥半薄切片，發(fā)現(xiàn)與野生型相比，EAR株系花藥第9-10階段絨氈層降解延遲，第9階段絨氈層肥大、小孢子降解，第12階段花粉敗育；OE花藥絨氈層發(fā)育不良且降解提前，第9階段無完整絨氈層，第10階段降解，第11階段花粉敗育。相關基因轉錄水平檢測顯示，DYT1、MYB35（TDF1）等絨氈層發(fā)育基因，在OE和EAR花序中表達均較低；絨氈層降解相關的CEP1、PASPA3基因在OE中表達顯著高于野生型，EAR中CEP1表達降低。綜上表明，ANAC106是花藥絨氈層細胞程序性降解的重要正調控因子。

圖3. 過表達和顯性負抑制對ANAC106在擬南芥花粉中的發(fā)育具有相反的影響

為鑒定ANAC106在調控絨氈層降解中的直接靶基因，通過DAP-seq鑒定出10665個潛在結合位點，核心序列為“MRRYGSCGTNDHNDHNMCGBHRH"，該CGT(7n)MCG基序與已知NAC成員保守，且發(fā)現(xiàn)ANAC106結合GA3ox2啟動子與GA3ox4第1外顯子。GO富集分析顯示赤霉素代謝基因富集。同時作者構建了DEX誘導型株系，發(fā)現(xiàn)DEX處理致花發(fā)育缺陷及雄性不育。RNA-seqGO富集分析顯示，均富集赤霉素生物合成過程調控，且僅赤霉素處理上調ANAC106表達。EMSA、qPCR和雙熒光素酶實驗進一步證實了ANAC106結合并激活GA3ox2/4表達。此外，還發(fā)現(xiàn)ANAC106還靶向GA2ox1。綜上表明，ANAC106可能通過靶向赤霉素合成與失活基因調控活性赤霉素平衡。

圖4. ANAC106直接調控擬南芥赤霉烯（GA）代謝相關基因表達

為驗證ANAC106對活性赤霉素（GA）水平的調控作用，作者通過UHPLC-MS/MS檢測相關轉基因株系，結果顯示經(jīng)DEX處理的OE株系活性GA含量顯著升高，EAR株系GA水平略低或與野生型持平，表明ANAC106雙向調控GA合成與失活。Westernblot結果顯示，OE株系中DELLA蛋白（RGA、GAI）豐度顯著降低，EAR株系中DELLA蛋白積累；DEX誘導ANAC106表達可促進RGA/GAI降解，且蛋白酶體抑制劑MG132能抑制該過程，表明ANAC106通過GA依賴的泛素-蛋白酶體途徑降解DELLA。作者進一步構建MYC-GAI轉基因株系并與GVG:ANAC106雜交，發(fā)現(xiàn)DEX處理的雙轉基因株系MYC-GAI水平降約50%，且降解同樣依賴泛素-蛋白酶體途徑。此外，OE株系不育表型與rga/gai雙突變體相似，OE花序中RGA豐度降低、EAR株系中升高，進一步表明DELLA蛋白參與ANAC106調控的花粉發(fā)育。

圖5. ANAC106正向調控擬南芥中生物活性赤霉素（GAs）的水平，并負向影響DELLA蛋白的豐度

為進一步探究ANAC106與DELLA蛋白的關系，作者構建了兩個RGA-eYFP轉基因株系（分別由絨氈層特異性LTP12啟動子和花粉特異性LAT52啟動子驅動），并與ANAC106-OE株系雜交獲得雙轉基因株系。結果顯示，兩種雙轉基因株系的不育表型均顯著恢復：可產(chǎn)生可育角果。亞歷山大染色顯示花粉活力大幅提升，半薄切片顯示絨氈層提前降解缺陷得到改善。以上結果表明，在ANAC106調控的花粉發(fā)育基因網(wǎng)絡中，DELLA蛋白在下游發(fā)揮重要作用。

圖6. ANAC106通過赤霉素（GA）-DELLA通路調控擬南芥雄性生殖力

酵母雙雜交（Y2H）實驗結果顯示，擬南芥5種DELLA蛋白中，除RGL1外，其余4種均能與ANAC106相互作用。免疫共沉淀（Co-IP）結果進一步證實，RGA和GAI在體內可與ANAC106蛋白相互作用。進一步分析發(fā)現(xiàn)，RGA和GAI均與ANAC106的N端區(qū)域（含DNA結合結構域）相互作用，而不與C端相互作用。隨后，作者在擬南芥葉肉原生質體中進行了瞬時表達實驗。結果顯示，ANAC106可激活GA3ox2、GA3ox4的熒光素酶活性，而RGA或GAI可劑量依賴地抑制該活性。綜上表明，DELLA蛋白與ANAC106的相互作用以劑量依賴方式抑制ANAC106的轉錄活性。

圖7. DELLA蛋白抑制ANAC106的轉錄活性

本研究揭示擬南芥中DELLA-ANAC106雙向負反饋回路調控赤霉素（GA）穩(wěn)態(tài)、維持雄性育性的機制：新發(fā)現(xiàn)的NAC轉錄因子ANAC106可激活GA合成基因（GA3ox2、GA3ox4）以提升活性GA水平，促進DELLA蛋白降解；而DELLA蛋白（如RGA、GAI）則以劑量依賴方式與ANAC106互作，抑制其轉錄活性，避免GA過量。ANAC106過表達（功能獲得）致絨氈層提前降解，顯性負抑制（功能缺失）致其延遲降解，二者均引發(fā)雄性不育。該回路通過自我校正實現(xiàn)花藥GA時空精準調控，為植物生殖激素調控提供新范式。

圖8. DELLA-ANAC106反饋回路調控擬南芥花粉發(fā)育的功能模型