2025年6月10日，西北農(nóng)林科技大學(xué)秦濤教授團隊在Plant, Cell & Environment發(fā)表了題為“NAC Transcription Factor LpNAC22 Positively Regulates Drought Tolerance in Perennial Ryegrass"的研究論文。該研究從多年生黑麥草中分離出干旱誘導(dǎo)的NAC轉(zhuǎn)錄因子LpNAC22，借助DAP-seq系統(tǒng)解析了LpNAC22通過調(diào)控LEA家族基因增強耐旱性的分子機制，為牧草抗旱分子育種提供了關(guān)鍵理論依據(jù)與基因靶點。
研究背景
多年生黑麥草是全球溫帶地區(qū)廣泛使用的牧草和草坪草，但對干旱敏感，缺水會導(dǎo)致生長、turf質(zhì)量和生產(chǎn)力下降。植物通過分子和生理機制抵抗干旱，其中轉(zhuǎn)錄因子（如NAC）起重要調(diào)控作用。盡管NAC在多種植物中被證明與耐旱相關(guān)，但多年生黑麥草中NAC的耐旱調(diào)控機制尚不明確。
技術(shù)路線
研究結(jié)果
作者從多年生黑麥草中分離出13個與NAC轉(zhuǎn)錄因子高度同源的編碼序列，其中LpNAC22在干旱脅迫后轉(zhuǎn)錄水平更高，且在高抗旱性品種中表達(dá)量顯著高于低抗旱性品種。系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與多個干旱響應(yīng)型NAC蛋白屬于同一亞組。亞細(xì)胞定位表明LpNAC22定位于細(xì)胞核，轉(zhuǎn)錄活性分析顯示其具有轉(zhuǎn)錄激活功能，且轉(zhuǎn)錄激活區(qū)域位于C端（138-331氨基酸）。
圖1. LpNAC22轉(zhuǎn)錄因子的基因表達(dá)分析與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。
圖2. LpNAC22的亞細(xì)胞定位與轉(zhuǎn)錄活性分析。
作者接著研究了LpNAC22在調(diào)控多年生黑麥草耐旱性中的功能。干旱處理誘導(dǎo)LpNAC22表達(dá)后，其在擬南芥和多年生黑麥草中過表達(dá)均能提高植株存活率、相對含水量和葉綠素含量，降低丙二醛含量、離子滲漏和活性氧積累，減輕細(xì)胞損傷，增強耐旱性。進(jìn)一步構(gòu)建了兩個突變株系（Ri2和Ri3），干旱處理前突變株系與野生型植株表型和生理指標(biāo)無差異；但干旱處理后，突變株系存活分蘗率、株高、干重、相對含水量和葉綠素含量均低于野生型，離子滲漏率、丙二醛含量及活性氧積累則高于野生型，表明LpNAC22突變會導(dǎo)致細(xì)胞膜損傷加劇。以上結(jié)果表明，LpNAC22在多年生黑麥草抗旱性調(diào)控中起正向作用。
圖3. LpNAC22過表達(dá)增強了轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草的耐旱性。
圖4. LpNAC22基因突變削弱多年生黑麥草的干旱處理耐受性。
為探究LpNAC22調(diào)控抗旱性的機制，作者通過DAP-seq分析，發(fā)現(xiàn)9165個啟動子片段被富集，覆蓋5195個基因。GO富集分析表明其中富集多種脅迫響應(yīng)基因，包括水分剝奪相關(guān)基因。值得注意的是，8個LEA家族基因的啟動子區(qū)域在DAP-seq結(jié)果中呈現(xiàn)顯著富集，結(jié)合生理實驗中LpNAC22過表達(dá)植株細(xì)胞膜損傷減輕的表型（MDA含量降低、離子滲漏減少），推測LpNAC22可能通過調(diào)控LEA基因表達(dá)保護細(xì)胞膜以增強抗旱性。進(jìn)一步通過酵母單雜交（Y1H）實驗驗證發(fā)現(xiàn)，LpNAC22能特異性結(jié)合LpLEA1和LpLEA2-1的啟動子片段，并激活LacZ報告基因表達(dá)。后續(xù)經(jīng)ChIP-qPCR、EMSA及熒光素酶報告基因實驗多維度驗證，證實LpNAC22可直接結(jié)合上述LEA基因啟動子并激活其轉(zhuǎn)錄。
圖5.LpNAC22直接調(diào)控LpLEA1和LpLEA2-1的表達(dá)水平。
大量研究表明膜穩(wěn)定是LEA蛋白響應(yīng)干旱脅迫的主要機制。本研究發(fā)現(xiàn)，干旱處理可誘導(dǎo)LpLEA1和LpLEA2-1表達(dá)，且其編碼蛋白定位于細(xì)胞膜，暗示二者可能在干旱下維持膜完整性。因未能獲得過表達(dá)這兩個基因的轉(zhuǎn)基因多年生黑麥草，故用擬南芥轉(zhuǎn)基因株系分析表型。結(jié)果顯示，干旱條件下野生型多數(shù)萎蔫，而過表達(dá)株系存活率更高，離子滲漏率和MDA含量更低。這些結(jié)果表明，LpLEA1和LpLEA2-1能減輕細(xì)胞膜損傷，增強植株抗旱性。
圖6. LpLEA1和LpLEA2-1的過表達(dá)可緩解干旱條件下植物細(xì)胞膜的損傷。
研究結(jié)論
本研究鑒定了多年生黑麥草中的干旱誘導(dǎo)型核轉(zhuǎn)錄激活因子LpNAC22，證實其通過直接調(diào)控LEA家族基因LpLEA1和LpLEA2-1的表達(dá)來增強植物的耐旱性，為多年生黑麥草的耐旱分子育種提供了重要的基因資源和理論依據(jù)。
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